Complementair aan een ecotoxicologische karakterisatie van complexe afvalwaters kan een procedure voor toxiciteitsidentificatie en ?evaluatie (TIE, 3 fases) uitgevoerd worden om de stoffen te identificeren die oorzaak zijn van de toxiciteit. In dit eindwerk wordt Fase II van de TIE-methode op punt gesteld. Doel van TIE-fase II is om na fractioneren van het toxische afvalwater via HPLC, deze fracties d.m.v. biologische testen opnieuw te evalueren. Hierna kunnen dan, enkel die specifieke fracties die een toxische respons opleveren, weerhouden worden voor gespecialiseerde chemische analyses en identificatie. In dit werk werd gebruik gemaakt van 2 biologische testen, namelijk een bacteriële genotoxiciteitstest, de umuC-test en de algen groei-inhibitietest. Beiden zijn snelle screeningstesten die kleine volumes gebruiken vanwege de uitvoering in microtiterplaten.
In een eerste stap werd vooral gewerkt rond aspecten die te maken hebben met de HPLC fractionatie zelf. Bij toepassing van de HPLC heeft men altijd te maken met een dood volume. Doordat er gewerkt wordt met twee verschillende injectiemethodes, verkrijgt men twee verschillende dode volumes die bepaald werden en waarmee in het verder verloop moet rekening gehouden worden om na te gaan in welke fractie een stof zich bevindt. Ook de keuze van de mobiele fase, een solvent dat mogelijk ecotoxiciteit veroorzaakt in de biologische testen of kan verdampen, is cruciaal. Vergelijkende experimenten met acetonitrile en methanol hebben aangetoond dat dit laatste de voorkeur geniet. Bovendien bleek bij bereiding van de HPLC-fracties voor toxiciteitstesten dat volledig indampen van het extract, en vervolgens reconstitueren in het juiste volume van testmedium de aangewezen methode is.
In een tweede luik werd er nagegaan of een ecotoxische stof uit afvalwater te detecteren is in de testen na fractionatie. Vanwege projecten in uitvoering omtrent afvalwaters van ziekenhuizen, werden 2 medicijnen metronidazole en furazolidone voor de umuC-test gekozen, terwijl voor de algen groei-inhibitietest metronidazole en natrium pentachloorfenolaat als positieve controles fungeerden. De toxische respons van deze stoffen in elk van de testen werd bevestigd via het opstellen van dosiseffect curven. Op basis hiervan werden teststofconcentraties bepaald van de te injecteren oplossing voor HPLC-fractionatie. Voor beide biologische testen werd een goede detecteerbaarheid van stoffen na fractionatie aangetoond, hoewel het signaal soms lager bleek dan verwacht. Hiervoor zijn enkele oorzaken gesuggereerd die verder onderzocht moeten worden.
Tot slot werd de HPLC-fractionatie toegepast op een reëel staal, namelijk ziekenhuisafvalwater. Dit complexe afvalwater werd in 50 fracties verdeeld voor evaluatie van genotoxiciteit met de umuC-test. Het signaal voor genotoxiciteit kon voornamelijk toegeschreven worden aan fracties 40-50, die voor chemische identificatie geselecteerd kunnen worden in vervolgonderzoek.

Auteur: Karlien Boven
Herkomst: KHK, Eindwerk Industrieel Ingenieur in Landbouw en Biotechnologie- nr eindwerk2004234.pdf
Referentie: Referentie